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酶切体系的建立

酶切体系的建立

发布时间:2019-01-16

酶 切 反 应
(Setting Up a Restriction Endonuclease Reaction)

一、 建立一个标准的酶切反应
 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量,对许多酶来说,相应延长反应时间(不超过16小时)也可完全反应。

二、 选择正确的酶
 不言而喻,选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链,一个识别4个碱基的酶将平均在每44(256)个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的(3''或5''突出端),也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接,而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、 酶
 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是*后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如,超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA
 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染,以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容,参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、 缓冲液
 对于每一种酶NEB都提供相应的*佳缓冲液,可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现*佳活性。在这种情况下,我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。

六、 反应体积
 内切酶活力单位的定义是:1小时内,50μl反应体积中,降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶:DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下,要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。

七、 混合
 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全,必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合,或是用手指轻弹管壁混合,然后再快速离心一下即可。注意:不可振荡!

八、 反应温度
 大部分酶的反应温度为37°C;从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°C不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37°C。

九、 反应时间
 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多,可以相应地缩短反应时间;反之,如果加入的酶量较少,也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、 终止反应
 如果不进行下一步酶切反应,可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液:50%的甘油,50mM EDTA(pH8.0),和0.05%溴酚蓝(10μl/50μl反应液)。如果要进行下一步酶切反应,可用热失活法终止反应(65°C或85°C,20分钟)。热失活并不能适用于所有的酶,详情参见第240页热失活表。此外,酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存
 大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存,否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性
 每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测;*近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验,我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分稳定。高于-20°C条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应
 如果发现您的DNA底物不能被成功切开,可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下:
 将不加内切酶的底物DNA(待切底物)与加入了内切酶的对照DNA(有多个已知酶切位点)同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解,则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染;若实验结果发现底物DNA保持完整,而对照DNA被成功切开,则可以排除酶质量的原因,此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应,以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在(通常是盐、EDTA或酚),则混合物里的对照DNA也无法被切开。


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