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生化试剂,常见问题的解决方法

生化试剂,常见问题的解决方法

发布时间:2020-01-20

试剂空白吸光度是反映试剂质量的目标之一,但不能反映试剂质量的悉数。试剂成份、纯度、用量及安稳性,才是确保试剂质量的关键所在。目前市售的一些试剂具有抗搅扰效果,主要是经过参加抗搅扰物质或运用新的色素原以防止内源性物质的搅扰。但值得注意的是:一些实验项目在消除内源性物质搅扰的一起,会带来样品含量真实性的改变。
1 试剂空白
试剂空白吸光度是反映试剂质量的目标之一。每种试剂都有必定的空白吸光度规模,试剂空白吸光度的改动往往提示该试剂的蜕变;如运用Trinder反响为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为赤色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分化出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变污浊。这些状况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反响,在放置进程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上,吸光度上升的反响,其试剂空白吸光度越低越好,不能超越一个高限;相反,吸光度下降的反响,其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因而,试剂空白吸光度限值,常作为程序参数输入仪器,如经核对超限,仪器会主动报警,提示替换试剂。需求指出的是,还原型辅酶I(或II)等投料量缺乏或残次的原料,往往需求加大用量,才使“表观”吸光度上升,将就过试剂空白核对的“关”,其成果为如下状况:
1线性规模变窄 现象:高值测不高。原因:生产试剂时有效成分投料量缺乏;试剂成份安稳性较差。
2 灵敏度变低现象:酶促反响速度曲线斜率下降,测定成果有严峻系统误差。原因:试剂底物浓度缺乏。
3 低值偏高 现象:试剂空白的改变曲线(吸光度VS时刻)明显动摇。原因:试剂本身不安稳,自行分化;东西酶纯度不行,杂酶含量超限,导致搅扰效果。
2 样品信息
样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定成果发作非化学反响的搅扰。因而,应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性,采用双波长或多波长的检测模式,并在成果核算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响,削减搅扰程度。
3 测定规模
每种待测物都有一个可测定的浓度或活性规模,样品成果若超越此规模,分析仪将显现成果超越规模的提示。表示试剂现已蜕变,应替换合格试剂。
4 底物耗尽
运用接连监测法、两点法测定酶活性时,若酶活性十分高,底物挨近被耗尽,吸光度上升或下降会超越某一吸光度改变规模,监测期的吸光度将违背线性,使测定成果不可靠。
5 酶的预活化
测定血清中的某些酶,如CK,离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只要经过恰当的还原效果才干从头激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂,名为N一乙酰半胱氨酸。实验研讨证明,NAC对血清中已失活的CK活化进程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时刻较长的理论依据。在AST,ALT采用IFCC推荐办法测守时需求磷酸吡哆醛预活化。需求着重:含有活化剂的生化试剂,其测定酶活性的成果要高些。
6 试剂抗搅扰效果的合理性有些液体双试剂,其实质并不真正具有抗搅扰的能力而只是处理了试剂的液体化和安稳性问题。如,ALT试剂盒中,NADH在pH7.5~7.8水溶液中极不安稳,在pH>8.7时才干安稳保存。因而,为了确保试剂安稳性,液体双试剂的R1需求保持pH>8.7,但此刻LDH活性大大下降,就失掉消除内源性丙酮酸的功用,只要参加试剂R2后,反响混合液的pH下降至LDHzui适pH,在经过延迟时刻60 S后,才干消除内源性丙酮酸的搅扰。再如,Tfinder反响中抗Vc搅扰问题:由于维生素c易氧化,样品中Vc会竞争反响生成的过氧化氢,而发作负搅扰。因而,在试剂R1中参加抗坏血酸氧化酶,这种办法是有效的,但不必定有很大的含义。由于Vc搅扰有必要一起具有二个条件:a)Vc摄入量较多;b)采血后当即测定。实验标明离体血清中Vc在90 min后会悉数被氧化。又如,运用胺类新色原。a)分子共轭结构特性使得灵敏度进步,相应能够削减样本用量,zui终能有效地下降搅扰物的量.b)使生成胺类色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上,以避开黄疸、溶血搅扰。如:亚铁氰化钾一H 0 ,能有效防止黄疸搅扰的理论依据是亚铁氰化钾与H。0。亲和力远远大于胆红素。甘油三酯测定,有人主张选用双试剂办法消除内源性甘油,这个办法是可行的,但忽视了一个化学平衡理论。由于一切的酯在水溶液中都不是简略地以酯的方式存在,而是以水解与酯化相平衡的方式存在。在一个平衡系统中,假如去除游离甘油,这个平衡就向生成甘油方向移动,甘油三酯就会从头水解,生成新的甘油,到达新的平衡,因而样品与R1试剂孵育时刻越长,测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定,不只要去除游离甘油,而且还要战胜样本含量真实性发作的改变,试剂中有必要参加甘油激酶,而且延迟时刻要标准化。所以,一些实验项目在消除内源性物质搅扰的一起,会带来样品含量真实性的改变。